Le rapport d'examen de l'EMA pour les vaccins COVID-19 de Pfizer/BioNTech a mentionné que la fabrication de la substance active pour le vaccin BNT162b2 comprend cinq étapes clés. Parmi eux, les molécules d'ARN sont synthétisées à partir d'ADN linéaire par unIn vitroTranscription (IVT)
Suivi par la purification et la filtration en plusieurs étapes.
Le rapport recommandait que le sponsor mette en œuvre des stratégies de test pour assurer un contrôle microbien adéquat du matériau de départ et que le tampon HEPES dans la formulation tampon soit exempt de RNase.
En ce qui concerne les spécifications des excipients, le rapport indiquait que le tampon éthanol et acide citrique d'aide à la transformation devrait être contrôlé conformément à la Pharmacopée européenne (Ph.Eur.), avec le tampon HEPES et les spécifications EDTA comparés à ceux de la substance active.
D'après ce qui précède, Pfizer/BioNTech a utilisé le tampon HEPES dans la fabrication de vaccins COVID-19 d'ARNm. Le rapport d'examen a également souligné la nécessité pour le tampon HEPES d'être sans RNase.
Basé sur l'article sur la formulation LPX-ARNm publié par BioNTech en 2016, le tampon HEPES a été utilisé dans la solution de stock d'ARNm de la société. On pourrait en déduire que BioNTech a utilisé HEPES comme système tampon pour la solution mère d'ARN lors de la fabrication de ses vaccins COVID-19 d'ARNm.
HEPES a été utilisé comme tampon dans la solution mère d'ARNm, qui peut être étroitement liée à l'IVT de l'ARN polymérase.
L'utilisation de la paire tampon HEPES pour la réaction IVT a été rapportée dans une étude dès 1987. Dans l'étude, l'ARN polymérase du virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (IHNV) a été étudiée pour l'IVT dans différentes conditions de réaction. Les résultats ont montré que le tampon HEPES pouvait maximiser l'efficacité IVT par rapport au tampon Tris.
L'étude a montré que, par rapport àTampon TRIS de trométhamine, La synthèse d'ARN a été triple plus élevée lorsque HEPES a été utilisé comme tampon (Fig. 1a), et la concentration optimale de tampon HEPES était de 400 mM.
Robin Shattock, directeur du département des maladies infectieuses de l'Imperial College of Science, Technology and Medicine, est un expert faisant autorité dans le domaine des vaccins contre l'ARNm et travaille en étroite coopération avec BioNTech, PNI et d'autres sociétés biopharmaceutiques de premier plan. Son équipe a publié un article sur l'optimisation de l'IVT du saRNA en 2021 et a déclaré que l'utilisation de 40 mM HEPES comme tampon pour la réaction IVT contribue à une efficacité IVT plus élevée. La conclusion a été tirée par le dépistage et l'étude des principaux facteurs qui affectent l'IVT du saRNA.
Selon l'article sur la formulation LPX-ARNm publié par BioNTech en 2016, le tampon utilisé dans la solution de stock d'ARNm de la société était HEPES. Dans l'étude, RNA-LPX a été préparé en préparant une solution mère ARN 1 mg/mL à l'aide d'un tampon HEPES.
Selon la littérature pertinente, HEPES présente des avantages en tant que tampon pour la réaction IVT, ce qui, selon nous, est la raison pour laquelle BioNTech utilise la paire tampon HEPES comme système tampon pour sa solution de stock d'ARNm.
1. Le pKa de HEPES varie très peu avec la température, et le pH se déplace peu avec la température.
2. les propriétés sont stables. HEPES, d'une part, ne se complexe pas avec d'autres ions et affecte les autres fonctions ioniques; d'autre part, la présence d'autres ions n'affecte pas la capacité tampon de HEPES.
3. le pH dans le milieu de culture cellulaire est principalement maintenu par le bicarbonate et 5% CO2Dans le milieu. Lorsque les cellules sont dans un environnement ouvert, CO2L'évasion peut entraîner une augmentation rapide du pH hors de la plage physiologique, mais ce n'est pas un issUe pour le support complété par des paires de tampons HEPES.
4. HEPES ne peut pas facilement traverser les biofilms et n'interfère pas avec les réactions biochimiques dans les cellules.
1. En raison de la présence du fragment pipérazine, H2O2Est produit lorsque HEPES est exposé à la lumière, qui est toxique pour les cellules cultivées ou d'autres substances biologiquement actives. HEPES ne doit pas être utilisé en combinaison avec des substances sensibles à redox. HEPES en tant que tampon doit être utilisé à l'abri de la lumière directe du soleil.
2. HEPES est couramment utilisé à des concentrations de 10 à 25 mM dans les produits biochimiques. Il a une faible capacité tampon lorsque la concentration est inférieure à 10 mM et peut avoir un effet toxique sur certaines cellules lorsque la concentration est plus élevée.
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Références:
1. GAEL KURATH * t, LEONG J C. Transcription in vitro du virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse, un rhabdovirus de poisson [J]. Le Journal de virologie générale, 1987(68): 1767-1771.
2. Samnuan K, Blakney AK, McKay PF, Shattock RJ. Conception d'expérimentations Optimisation du rendement de la transcription vitro de l'ARN auto-amplificateur. bioRxiv; 2021.
3. Rapport d'évaluation de l'EMA, Nom commun: Vaccin d'ARNm COVID-19 (modifié par les nucléosides).
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