Application du tréhalose dans la cryoconservation cellulaire: cryoconservation des cellules germinaires testiculaires de souris

Dans les deux numéros précédents, nous avons partagé des études pertinentes sur l'utilisation du D ()-tréhalose dihydraté pour la cryoconservation de cellules précurseurs d'oligodendrocytes d'origine humaine (OPC) et les cellules souches dérivées d'adipeux (ADSC). Ces études ont révélé que l'ajout d'une certaine quantité de D ()-tréhalose dihydraté au milieu de cryoconservation ou l'utilisation du cryoprotecteur composite de D ()-le tréhalose dihydraté glycérol pourrait améliorer le taux de récupération des cellules souches après une cryoconservation à long terme, contribuant ainsi à l'application clinique ultérieure de cellules souches pour le traitement de la maladie ou la réparation des plaies.

Dans ce numéro, nous prenons la cryoconservation des cellules germinales testiculaires de souris comme exemple pour explorer les perspectives d'application du D ()-tréhalose dihydraté dans le domaine de la procréation assistée.

Effets de différents cryoprotecteurs sur la cryoconservation des cellules germinales testiculaires chez les souris immatures

Arrière-plan de la cryoconservation des cellules de germes testiculaires

Ces dernières années, avec le développement rapide de la technologie de procréation assistée, il est devenu possible pour de plus en plus d'hommes infertiles de donner naissance à une progéniture. Dans le processus, la cryoconservation à long terme des cellules associées à la reproduction est devenue l'une des principales difficultés techniques affectant le taux de réussite.

Par exemple, pour les patients masculins prépubères atteints de cancer, le traitement par toxicité gonadique peut entraîner une perte permanente de fertilité, et la cryoconservation à long terme du tissu testiculaire ou des cellules à basse température est un moyen important de préserver leur fertilité.

Cependant, pour les patients atteints de tumeurs systémiques, la transplantation autologue de tissu testiculaire cryoconservé après décongélation présente un risque de réintroduction de cellules cancéreuses. Considérant que les cellules cancéreuses peuvent être isolées de la suspension de cellules testiculaires et que les cellules souches spermatogoniales (SSC) peuvent être cultivées in vitro pour induire une différenciation en spermatides ronds, donner naissance à la progéniture peut être atteint par injection ronde de spermatide.

Par conséquent, pour les patients masculins prépubères atteints de cancer, la cryoconservation à long terme des cellules germinales testiculaires est l'un des principaux moyens de préserver la fertilité masculine et a une valeur d'application clinique potentielle.

Zhang Xiaolong de l'hôpital populaire de la province du Henan et d'autres chercheurs ont utilisé des souris de deux semaines pour simuler l'état de développement du tissu testiculaire immature humain avant la puberté, et a adopté différents protocoles de cryoconservation pour cryoconserver les cellules germinales testiculaires de souris afin d'explorer la meilleure méthode de cryoconservation.

Comparaison des effets de différents cryoprotecteurs

Dans l'étude, les médias de cryoconservation ont été divisés en 5 groupes suivants selon les différentes composantes:

La suspension de cellules germinales testiculaires de souris a été préparée par hydrolyse enzymatique en deux étapes, distribuée et transférée dans des flacons cryogéniques après avoir ajouté respectivement chacun des cinq cryoprotecteurs différents. Les flacons cryogéniques ont été soumis à une congélation programmée, retirés du réservoir d'azote liquide après 2 mois et récupérés pour détecter le taux de survie cellulaire, le taux d'apoptose et le potentiel de la membrane mitochondriale.

Résultats de l'étude

① Taux de survie cellulaire et taux de récupération avant et après la cryoconservation

Par rapport à celui d'avant la cryoconservation, le taux de survie des cellules après cryoconservation a diminué dans les cinq groupes de test. Parmi eux, le taux de survie cellulaire et le taux de récupération dans le groupe E étaient significativement plus élevés que ceux des quatre autres groupes de test.

② Récupération cellulaire après cryoconservation

Dans chaque groupe, le taux de récupération des cellules germinales testiculaires après cryoconservation a été évalué quantitativement sur la base du nombre de cellules viables réellement récupérées de 4 mg de tissu testiculaire dissocié et cryoconservé après décongélation. Les résultats ont montré que le nombre de cellules récupérées dans le groupe E était significativement plus élevé que celui des quatre autres groupes de test.

③ Taux d'apoptose

Le taux d'apoptose a été détecté par cytométrie en flux (FC) dans chaque groupe. Les résultats ont montré que le taux d'apoptose était significativement augmenté dans chaque groupe de test par rapport au groupe témoin. Dans les cinq groupes de test, le taux d'apoptose dans le groupe E était significativement inférieur à celui des quatre autres groupes de test.

④ Potentiel de la membrane mitochondriale

Par rapport au groupe témoin, le potentiel de membrane mitochondriale des cellules cryopréservées a diminué de manière significative après décongélation dans les cinq groupes de test, avec la plus petite diminution du groupe E, qui était nettement inférieur à celui des quatre autres groupes de test.

Discussion

Les cryoprotecteurs peuvent être classés comme perméables et imperméables. Les cryoprotecteurs imperméables les plus couramment utilisés sont le saccharose et le D ()-tréhalose dihydraté. Une étude précédente a confirmé que l'ajout de saccharose ou de dihydrate de D ()-tréhalose à des cryoprotecteurs pourrait augmenter considérablement le taux de récupération des cellules germinales testiculaires chez les singes rhésus ou les souris.

Les résultats de l'étude ci-dessus ont montré que l'ajout de 0.1 mol/L de saccharose ou 0.1 mol/L D ()-tréhalose dihydraté au cryoprotecteur avait un certain effet protecteur sur la cryoconservation cellulaire, tout en ajoutant 0.1 mol/L de saccharose et 0.1 mol/L D ()-tréhalose dihydraté en même temps, on augmentait considérablement le taux de récupération des cellules germinales testiculaires cryopréservées de souris après décongélation, A diminué le taux d'apoptose et réduit les dommages au potentiel de membrane mitochondriale causés par la cryoconservation.

Cependant, la cytotoxicité causée par la concentration plus élevée de DMSO (15%) a partiellement compensé l'effet cryoprotecteur du saccharose et du D ()-tréhalose dihydraté.