Recherche sur l'application du tréhalose dans la cryoconservation cellulaire: cryoconservation OPC

Le D ()-tréhalose dihydraté est un disaccharide stable non réducteur. Il peut former un film protecteur à la surface des cellules sous diverses contraintes environnementales telles que la chaleur extrême, le froid, la sécheresse, efficacement pour protéger efficacement la structure des macromolécules biologiques contre les dommages. Il a une excellente fonction protectrice non spécifique pour les cellules biologiques et peut améliorer la résistance des cellules biologiques à des conditions difficiles.

Ces dernières années, le D ()-tréhalose dihydraté a été largement utilisé dans les produits biologiques, y compris les médicaments anticorps. Il est utilisé comme agent protecteur pour environ 30% des anticorps sur le marché (y compris les ADC), tels que Adcetris, Padcev, Imjudo, Kimmtrak, etc.

Le dihydrate de D ()-tréhalose joue également un rôle de plus en plus important dans la cryoconservation cellulaire, la procréation assistée et d'autres domaines. Ici, l'équipe produit d'AVT interprète la littérature connexe suivante pour vous aider à comprendre les progrès de la recherche pertinente.

D ()-dihydrate de tréhalose pour la cryoconservation des OPC

1. Transplantation de cellules précurseurs d'oligodendrocytes (OPC) pour les maladies démyélinisantes

Les maladies démyélinisantes sont des troubles neurologiques caractérisés par une perte de la gaine de myéline, tels que les lésions de la moelle épinière (SCI), la sclérose en plaques (SEP), etc.

Les OPC peuvent se différencier en oligodendrocytes maturesIn vivo, Qui sont d'importantes cellules myélinisantes du système nerveux central et encapsulent les axones neuronaux pour constituer des structures de myéline. Par conséquent, la transplantation d'OPC est considérée comme une thérapie très potentielle pour les maladies démyélinisantes.

2. Méthodes et problèmes existants pour la cryoconservation des OPC

La cryoconservation des OPC est une étape critique dans la transplantation réussie des OPC humains.

Avant d'être utilisés en clinique, les OPC humains étaient cryoconservés avec le cryoprotecteur de 100 mL/L DMSO 900 mL/L FBS (la méthode proposée en 1984), avec un taux de récupération de 55% à 70%. La méthode n'a pas été optimisée pendant longtemps par la suite.

Étant donné que le DMSO est cytotoxique et que le FBS est immunogène, la méthode de cryoconservation ci-dessus ne convient pas à une utilisation clinique.

Afin d'explorer une méthode de cryoconservation humaine OPC plus économique, efficace et sûre qui peut être appliquée à grande échelle, liu Chang de la Southern Medical University et d'autres chercheurs ont optimisé la méthode ci-dessus en utilisant des OPC induits par des cellules souches neurales cérébrales fœtales humaines (hNSC).

3. Optimisation des méthodes pour la cryoconservation des OPC

① En comparant les effets de différentes méthodes sur le taux de récupération des OPC, il a été constaté que le taux de survie des cellules collectées par digestion était significativement plus élevé que celui par pipetage mécanique.

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Tableau 1: Taux de viabilité et de récupération des cellules avant et après la cryoconservation à l'aide de méthodes de perturbation mécanique et de digestion

Group Mécanique Groupe de Digestion

-Cryoprotecteur A-Cryoprotecteur A-Cryoprotecteur B-.

De la visibilité avant la cryoconservation après la récupération.

② Comparaison du taux de récupération des OPC cryoconservés avec quatre supports de cryoconservation différents par un refroidissement lent dans la boîte de congélation et un refroidissement rapide dans le réservoir d'azote liquide en phase vapeur.

Comme indiqué ci-dessous, il y avait une différence statistiquement significative dans les taux de récupération pour les deux taux de refroidissement. Les taux de récupération des quatre cryoprotecteurs étaient tous inférieurs à 30% par refroidissement rapide. Le taux de récupération du milieu de cryoconservation E complété par du D ()-tréhalose dihydraté était le plus élevé par un refroidissement lent dans la boîte de congélation, qui était de (75.73 ± 6.66)%.

③ Comparaison de l'effet de la durée de cryoconservation sur le taux de récupération des OPC

Les cellules cryopréservées dans le milieu de cryoconservation E avec le taux de récupération le plus élevé ont été sélectionnées pour les expériences ultérieures, et le taux de récupération a été comparé entre le court terme (<2 mois) cryoconservation et cryoconservation à long terme (6 mois), ne montrant aucune différence significative dans le taux de récupération entre les deux groupes.

④ Comparaison de l'activité de prolifération cellulaire

Le milieu de cryoconservation E avec le taux de récupération le plus élevé a été sélectionné pour la comparaison de la prolifération cellulaire. Le multiple de prolifération moyen a été comparé entre le groupe E du milieu de cryoconservation et le groupe témoin de culture normal après 3 fois de passage en série en même temps, et il n'y avait pas de différence significative entre les deux groupes. Après 7 jours de culture, il n'y avait pas de différence significative dans le taux de prolifération entre le groupe culturel normal et le groupe culturel post-dégel. Les résultats ont indiqué que l'activité de prolifération cellulaire des OPC était cryopréservée avec le milieu de cryoconservation contenant du D ()-tréhalose dihydraté, ce qui était comparable à celui des cellules non congelées.

Conclusion

L'étude a conclu que les OPC induits par le hNSC collectés par digestion et cultivés en adhérence peuvent être cryoconservés avec le milieu complet OPS contenant 70 ml/L DMSO 300 ml/L FBS 0.2 mol/mL D(+)-le tréhalose dihydrate pendant une longue période par refroidissement lent et réchauffement rapide dans la boîte de congélation, avec un taux de récupération moyen allant jusqu'à 75%. La récupération après cryoconservation n'a pas affecté l'expression de marqueurs spécifiques à l'OPC et la capacité de prolifération.

Le dihydrate de D ()-tréhalose est un cryoprotecteur imperméable à la membrane cellulaire non toxique provenant de nombreuses sources, qui s'est avéré avoir un bon effet de cryoconservation pour divers types de cellules tels que les hPBSC et les hESC. Dans cette étude, le milieu de cryoconservation complété par une faible concentration de D ()-dihydrate de tréhalose a atteint le taux de récupération le plus élevé dans tous les groupes expérimentaux, et les résultats de la prolifération et de l'expression du marqueur après culture ont indiqué que le milieu de cryoconservation ajouté avec D ()-le tréhalose dihydraté convenait également à la cryoconservation des OPC humains et pourrait améliorer le taux de récupération des cellules.